Povijest NIPT:
| 1997 | Otkriće slobodno cirkulirajućeg fetalne DNA, |
| 1997 | neinvazivno otkrivanje spola fetusa pomoću otkrivanja Y kromosomskih sekvencija, |
| 1998 | kvantitativna analiza slobodnog fetalne DNA u majčinom cirkulacijskom sustavu, |
| 1998 | neinvazivno otkrivanje RhD statusa fetusa, |
| 1999 | otkriće brze eliminacije slobodne fetalne DNK nakon rođenja, |
| 2000 | neinvazivni DNA test usmjeren na monogenske naslijeđene poremećaje (ahondroplazija), |
| 2008 | prve probne studije s naglaskom na neinvazivno otkrivanje aneuploidije fetusa, |
| 2009 | prva aplikacija i potvrda koncepta da sekvenciranje nove generacije (NGS) omogućava otkrivanje Trisomije 21 fetusa, |
| 2010 | detaljno karakterizirana raznolikost fragmentacije DNA majke i fetusa, |
| 2010 | neinvazivno određena detaljna genomska karta fetusa, |
| 2011 | komercijalni NIPT test na raspolaganju, |
| 2012 | neinvazivno određena genomska sekvencija fetusa, |
| 2015 | prvi neinvazivni DNA test na temelju krvi majke u Slovačkoj, koji se koristi u kliničkoj praksi - TRISOMY test. |
Princip testa
Naš test se temelji na genomsko-sekvencisjkoj analizi slobodne fetalne DNA izoliranog iz periferne krvi trudnice. Podaci dobiveni sekvecijskom analizom s malim pokrićem se ocjenjuje pomoću prilagođenog algoritma izračuna i utvrđeni su u skladu s postupkom, koji je objavljen u Bianchi et al. (2012) *
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Kliničko značenje
TRISOMY test se obavlja s ciljem otkrivanja trisomija fetusa s visokom osjetljivošću i specificnošću već u ranim stadijima trudnoće, i time smanjuje nužnosti amniocenteze,* koja nosi određeni rizik pobačaja uzrokovan vađenjem amnionske tekućine.
Unatoč vrlo visokoj osjetljivosti i specifičnosti u otkrivanju trisomija, TRISOMY test je TRISOMY test je test probira a ne dijagnostički test.
U praktičnom smislu, svaki pozitivni rezultat TRISOMY testa mora biti potvrđen invazivnim uzorkovanjem genetskog materijala fetusa (uzorkovanje plodne tekućine ili korionskih resica) i nakon toga genetskim ispitivanjem dobivenog uzorka (vidi reference).
Negativan rezultat testa trisomije isključuje prisutnost trisomije 21, 18 i 13 kod fetusa, te ne mora biti potvrđen uzorkom, koji se dobiva na invazivni način (vidi reference).
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Liječnik, koji preporučuje test
Test može preporučiti liječnik specijaliziran za ginekologiju i opstetriciju ili kliničku genetiku.
Osjetljivost i specifičnost
NIPT općenito karakterizira visoka osjetljivost i specifičnost. Testovi fetalne DNA, koje pružaju različiti laboratoriji, obično variraju u pojedinim tehničkim detaljima. To se odnosi na različitosti NIPT ključnih parametara, a to posebno na:
- stopu otkrivenih TRISOMY fetusa – Detection Rate (DR)
- stopu lažno pozitivnih rezultata – False Positive Rate (FPR)
Osjetljivost NIPT na trisomiju 21 i trisomiju 18 ovisi od konkretnog laboratorija, i tipično je u rasponu između 94,4 i 100 % uz 0 –2,5 % lažno pozitivnih rezultata.
Osjetljivost NIPT na trisomiju 13 je manja (79 – 92 %). Mogući neuspjeh NIPT može biti uzrokovan tehničkim razlozima ili činjenicom da je slučaj trudnoće s trisomijom 13 u našoj populaciji vrlo rijedak. Omjer lažne pozitivnosti se očekuje na razini od 1 do 2 %.
NIPT – otkrivanje kromosomskih
aneuploidija – pouzdanost
| Trial | Downov sindrom | |
| DR (n (%)) | FPR (n (%) | |
| Chiu et al., 2011 | 86/86 (100) | 3/146 (2,1) |
| Ehrich et al., 2011 | 39/39 (100) | 1/410 (0,24) |
| Palomaki et al., 2011 | 209/212 (98,6) | 3/1471 (0,20) |
| Bianchi et al., 2012 | 89/90 (98,9) | 0/410 (0,00) |
| Sparks et al., 2012 | 36/36 (100) | 1/123 (0,81) |
| Ashoor et al., 2012 | 50/50 (100) | 0/297 (0,00) |
| Norton et al., 2012 | 81/81 (100) | 1/2888 (0,03) |
| Celkem | 590/594 (99,3) | 9/5745 (0,16) |
TRISOMY test –
osjetljivost i specifičnost
| n = 203 | Osjetljivost | 95 % CI | Specifičnost | 95 % CI | nP |
|---|---|---|---|---|---|
| T21 | > 99 % | 90,97-100 % | > 99 % | 97,78-100 % | 39 |
| T18 | > 99 % | * | > 99 % | * | 5 |
| T13 | > 99 % | * | > 99 % | * | 2 |
n – ukupan broj uzoraka u validiziranoj studiji
nP – broj pozitivnih uzoraka
CI – Confidence Interval (Interval pouzdanosti)
* 95 % CI nije procjenjeno zbog nedostatka uzoraka
Broj uzoraka bez rezultat uz NIPT: < 5 %.
Broj uzoraka bez rezultata uz TRISOMY test: < 1 %.
Osjetljivost i specifičnost TRISOMY testa su u potpunosti usporedivi s drugim metodama NIPT. Rezultat analize temelji se na valjanosti studija i analizi referentnih uzoraka s poznatim kariotipom.
Svi trisomijski uzorci 21, 18 i 13 uključeni u studiju uzoraka pomoću TRISOMY testa uspješno su detektirani.
Jedinstvena metoda pripremanja uzoraka krvi
Sastavnim dijelom laboratorijskog postupka TRISOMY testa je jedinstveni postupak, koji osigurava povećanje udjela fetalne DNA u usporedbi sa izvornim stanjem i to zahvalujući fizičkoj razlici fetalne DNA i DNA majke . Zahvaljujući ovoj proceduri, laboratorij može nakon analize uzoraka TRISOMY testa dobiti prosječan udio fetalne DNA u iznosu od 16 % (prosječan udio fetalne DNA u objavljenim studijama varira od 10 do 13 %). Naime, u setu uzoraka koji su analiziran ovim posebnim postupkom, nije postignut manji udio fatalne DNA fetusa od 7,5 %, što značajno smanjuje rizik neuspjeha testa zbog niskog sadržaja fetalne frakcije DNA u uzorku testa.
Na osnovu karakteristike metode pripreme, analize i procjene uzorka trudnica sa zdravim fetusom i trudnica s fetusom s trisomijom kromozoma 21, koja je korištena u okviru valjanosti studije, moguće je statistički prosuditi mjeru i lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata, ovisno o udjelu fetalne DNA u krvi majke. Prema raspoloživim informacijama, znamo da je visina udjela fetalne DNA u krvi majke individualna a pojava uzoraka s niskom fetalnom frakcijom (< 4 %) otkrivena je kod manje od 5 % trudnica (prosječni udio fetalne DNA je oko 14,5 % **
U studiji valjanosti koji smo proveli, bilo je analiziranih 164 uzoraka uzetih od trudnica s normalnim fetusom i 39 uzoraka uzetih od trudnica s otkrivenom trisomijom kromozoma 21. Ishod ukazuje da prosječni udio fetalne DNA u uzorcima dobivenih od trudnica s fetusom pogođenim trisomijom kromozoma 21 je 16 % (plava krivulja u grafikonu 1). Uz ovakav udio fetalne DNA u majčinoj cirkulaciji, postoji vjerojatnost da će rezultat analize biti neinformativni 1 : 3×1013 a vjerojatnost da će rezultat biti lažno negativan (tj. neispravan) je manja od 1 : 9×1018.
Kod uzorka s najnižim udjelom fetalne DNA koje dostiže 7,5 % (crvena krivulja) postoji vjerojatnost pojave ~ 1 : 15, te je pojava lažno negativnog neispravnog) rezultata manja od 1 : 740.
Analiza uzoraka trudnica sa zdravim fetusom (plava krivulja) sugerira da je vjerojatnost pojave neinformativnog rezultata ~ 1 : 161, a vjerojatnost pojave lažno negativnog (tj. neispravnog) rezultata manja od 1 : 30.000.
Kako bi se smanjio rizik od lažno negativnih rezultata ili lažno pozitivnih rezultata uzrokovanih trudnoćom s niskom fetalnom frakcijom, za procjenu rezultata analize korištena je definirajuća zona neinformativnih rezultata pod nazivom “siva zona”. U našem prikazu (Grafikon 2) ova zona je obelježena sivom nijansom. Ako se uzorak nakon analize nalazi u ovoj zoni, potrebno ga je ponovno analizirati. Radi toga se zahtjeva ponavno uzimanje uzorka krvi majke u intervalu od dva tjedna.
** Hudecova I, Sahota D, Heung MM, Jin Y, Lee WS, Leung TY, Lo YM, Chiu RW.Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for fetal chromosomal aneuploidies.PLoS One. 2014 Feb 28;9(2):e88484. doi: 10.1371/journal.pone.0088484
Procjena podataka pomoću vlastitog algoritma
Podaci pojedinih NIPT testova dobivenih pomoću cijelo-genomske sekvencisjke analize slobodne fetalne DNA, se ocjenju pomoću zahtjevnih matematičkih modela koje variruju ovisno od korištenog postupka i samog laboratorija. Cilj ove procjene je odrediti tzv Z-score (Grafikon 4).
Vlastitim usavršenim algoritmom podataka TRISOMY testa možemo dostići višu srednju vrijednost Z-score analiziranih uzoraka u odnosu na metode obračuna naših konkurenta.
Viša srednja vrijednost Z-score pozitivnih uzoraka postignuta pomoću našeg usavršenog algoritma uz procjenu TRISOMY testa automatski će se odraziti na točnijoj raspodjeli negativnih i pozitivnih vrijednosti rezultata ispitivanja, te omogućava smanjenje tzv. sive zone (područje preklapanja), gdje nije moguće jasno odlučiti o pozitivnosti, odnosno negativnosti rezultata testa.
Interferencije
Budući da TRISOMY test koristi probirnu, a ne diagnostičku metodu, mogu se pojaviti lažno pozitivne i lažno negativne rezultati. Pozitivan rezultat analize mora biti potvrđen dijagnostičkom metodom koje je trenutno dostupna, odnosno genetskim ispitivanjem amnionske tekućine.
Negativan rezultat apsolutno ne isključuje niti jednu od analiziranih trisomija. Razlog može biti prirodni fenomen mozaicizma placente, sindrom nestajućeg blizanca, točkaste mutacije gena, inaktivacija gena ili druge vrste genetskih ili epigenetskih mehanizama, ili prisutnost strane DNA u krvi majke.
U određenom malom postotku slučajeva uzoraka nije moguće dobiti jasan rezultat NIPT. Takvi testovi smatraju se neuspješnim.*** Neuspjeh može biti uzrokovan neprikladno izvedenim uzimanjem krvi ili neprikladnim transportom uzoraka u laboratorij u nepovoljnim uvjetima.
Jedan od najčešćih razloga neuspješnosti testa je prije svega smanjeni udio fetalne DNA u dobivenom uzorku u odnosu na sadržaj DNA majke. Ako je udio fetalne DNA u uzorcima manji od 4 %, pouzdanost testa značajno pada (grafikon 5). Prema rezultatima koji su objavljeni u studijama, moguće je očekivati pojavu uzoraka sa smanjenim udjelom fetalne DNA frakcije u rasponu od 1,5 do 6,1 %.
Rezultati dobiveni procjenom uzoraka sa sadržajem fetalne DNA manjeg od 4 % nisu pogodni za interpretaciju.
*** M. M. Gil, M. S. Quezada, R. Revello, R. Akolekar, and K. H. Nicolaides, „Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis,“ Ultrasound Obstet. Gynecol. 45 (3), 249-266 (2015)